1.  AML疾病簡(jiǎn)介

急性髓系白血病（Acute Myeloid Leukemia，AML）是一種起源于髓系造血干細(xì)胞的惡性克隆性疾病，具有高度異質(zhì)性，其重要特點(diǎn)是髓系原始細(xì)胞在骨髓中異常增殖和積聚，抑制正常造血功能，主要表現(xiàn)為貧血、出血、感染等癥狀。AML是中國(guó)最常見(jiàn)的白血病亞型，占成人急性白血病的80%，中國(guó)的年發(fā)病率約1.6~2.3/10萬(wàn)，每年新發(fā)病人2.4萬(wàn)例。AML可以發(fā)生在任何年齡段，生存率較低。其中，60歲以下AML患者5年生存率為35-40%，60歲以上患者5年生存率為5-15%。

圖 1. AML疾病發(fā)病率預(yù)測(cè)

2.  FLT3基因簡(jiǎn)介

AML多起源于尚未分化為白細(xì)胞的骨髓原始細(xì)胞，由于基因突變、染色體異常等促使髓系干細(xì)胞分化受阻，失去分化成熟的能力，轉(zhuǎn)化為急性髓系白血病。

FLT3（FMS-like tyrosine kinase 3,FLT3）基因是Ⅲ型受體酪氨酸激酶(ReceptorTyrosine Kinase，RTK)家族成員的原癌基因，其表達(dá)的蛋白結(jié)構(gòu)包括5個(gè)免疫球蛋白（Ig）樣結(jié)構(gòu)域組成的胞外區(qū)，1個(gè)跨膜區(qū)，1個(gè)近膜區(qū)（JM），以及胞內(nèi)由激酶插入?yún)^(qū)分隔而成的兩個(gè)酪氨酸激酶（TK）區(qū), 對(duì)造血干細(xì)胞的正常發(fā)育起看至關(guān)重要的作用。FLT3突變是AML迄今已發(fā)現(xiàn)的基因突變中最為常見(jiàn)的類(lèi)型，30%左右的成年AML患者會(huì)出現(xiàn)FLT3基因突變，其中FLT3 ITD突變是最常見(jiàn)類(lèi)型，伴有該突變的AML患者往往預(yù)后較差，復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)增加，總生存期縮短。

圖2. FLT3基因結(jié)構(gòu)

FLT3的配體FL從淋巴細(xì)胞、造血干細(xì)胞以及骨髓間質(zhì)細(xì)胞釋放后，與FLT3受體結(jié)合后可以激活受體，導(dǎo)致受體同源二聚體化和自體磷酸化，從而通過(guò)PI3K-AKT/RAS-MAPK/STAT5信號(hào)通路活化引發(fā)一系列生長(zhǎng)和分化調(diào)控。

圖3. FLT3激活機(jī)制

FLT3基因突變主要包括兩種類(lèi)型：近膜結(jié)構(gòu)域的內(nèi)部串聯(lián)重復(fù)突變（FLT3-ITD）和酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的點(diǎn)突變或缺失（FLT3-TKD）。ITD突變是FLT3最常見(jiàn)的一類(lèi)突變，占65%左右，是指在基因近膜結(jié)構(gòu)域(JMD)插入了一段串聯(lián)重復(fù)序列，通常發(fā)生在JMD的精氨酸殘基595附近，位于14和15號(hào)外顯子上，插入的位點(diǎn)和序列多種多樣，長(zhǎng)度一般為3～400bp不等，它總是以三的倍數(shù)出現(xiàn)，保留了轉(zhuǎn)錄本的閱讀框（ORF）。插入的重復(fù)序列導(dǎo)致FLT3在無(wú)配體結(jié)合的情況下發(fā)生二聚體化并持續(xù)自我磷酸化，增強(qiáng)激活酪氨酸激酶活性，使得下游信號(hào)通路（RAS/MAPK、PI3K/AKT等）持續(xù)激活，導(dǎo)致細(xì)胞增殖失調(diào)，促進(jìn)AML疾病的發(fā)生發(fā)展等。FLT3-TKD突變常發(fā)生在激酶結(jié)構(gòu)域II，通常為氨基酸殘基的突變、插入或缺失，常發(fā)生在基因的20號(hào)外顯子上，主要的突變位點(diǎn)有D835、I836等，與FLT3-ITD相似，F(xiàn)LT-TKD突變同樣導(dǎo)致下游增殖途徑的激活，導(dǎo)致疾病的發(fā)生。

ITD和TKD兩種突變FLT3分子均是通過(guò)不依賴配體的二聚化和反式磷酸化激活的，突變型FLT3誘導(dǎo)多種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的異常激活，破壞正常造血細(xì)胞的增殖、分化與凋亡，導(dǎo)致白血病的發(fā)生，并與疾病進(jìn)展相關(guān)。

目前主要的FLT3靶向藥包括第一代FLT3抑制劑米哚妥林和索拉非尼，以及第二代FLT3抑制劑吉瑞替尼，奎扎替尼和在研的克立福替尼。

2017年Midostaurin（米哚妥林）被美國(guó)FDA批準(zhǔn)與標(biāo)準(zhǔn)化療聯(lián)合用于治療原發(fā)的含F(xiàn)LT3突變AML患者。Midostaurin（米哚妥林）是一種酪氨酸激酶抑制劑，可抑制多種受體，如野生型FLT3，F(xiàn)LT3突變型激酶ITD和TKD，KIT（野生型和D816V突變型），PDGFRα/β以及絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶C（PKC）。米哚妥林(Midostaurin)抑制FLT3受體信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)表達(dá)ITD和TKD突變的白血病細(xì)胞以及過(guò)表達(dá)野生型FLT3和PDGFR的細(xì)胞凋亡。它還可能抑制肥大細(xì)胞中的KIT信號(hào)傳導(dǎo)，細(xì)胞增殖和組胺釋放（并誘導(dǎo)凋亡）。在有717名先前未接受過(guò)AML治療的患者參與的隨機(jī)試驗(yàn)中，接受米哚妥林(Midostaurin)聯(lián)合化療的患者比單獨(dú)接受化療的患者活得更長(zhǎng)，盡管無(wú)法可靠地估計(jì)出特定的中位存活率。此外，與單獨(dú)接受化療的患者相比（中位數(shù)為3個(gè)月），接受米哚妥林(Midostaurin)聯(lián)合化療的患者出現(xiàn)某些并發(fā)癥（治療后60天內(nèi)未能達(dá)到完全緩解、疾病進(jìn)展或死亡）所經(jīng)歷的時(shí)間更長(zhǎng)（中位數(shù)為8.2個(gè)月）。

2018年 Gilteritinib （吉瑞替尼）在日本和美國(guó)相繼上市，是全球首個(gè)獲批上市的單藥治療攜帶 FLT3 突變的復(fù)發(fā) / 難治性 AML 的 FLT3 抑制劑。 2021 年 1 月 30 日，中國(guó)國(guó)家藥品監(jiān)督管理局（ NMPA ）批準(zhǔn)富馬酸吉瑞替尼片（ gilteritinib ， Xospata ）上市，用于治療采用經(jīng)充分驗(yàn)證的檢測(cè)方法檢測(cè)到攜帶 FLT3 突變的復(fù)發(fā)或難治性（耐藥） AML 成人患者。吉瑞替尼靶向 FLT3-ITD 和 FLT3-TKD ，潛在受益患者更多。 Gilteritinib 獲批基于三期 ADMIRAL 試驗(yàn)結(jié)果，該結(jié)果已經(jīng)發(fā)表于《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》。比起接受挽救化療的患者，接受吉瑞替尼治療能顯著延長(zhǎng)總生存期（ OS ）。接受吉瑞替尼治療的病患總生存期中位數(shù)為 9.3 個(gè)月，而接受挽救化療者為 5.6 個(gè)月 [ 風(fēng)險(xiǎn)比  = 0.64 (95% CI 0.49, 0.83), P=0.0004] 。

圖 5. 吉瑞替尼與挽救化療組患者總體生存情況

2019年Quizartinib（奎扎替尼）在日本獲批上市。Quizartinib是一款雙芳基脲類(lèi)FLT3選擇性抑制劑，2018年曾被美國(guó)FDA和歐洲藥品管理局（EMA）批準(zhǔn)用于復(fù)發(fā)/難治性AML的治療。研究顯示，Quizartinib可顯著抑制其AML細(xì)胞中FLT3磷酸化，對(duì)復(fù)發(fā)/難治性AML細(xì)胞的IC50值達(dá)0.3 nM，目前已成為臨床上首選FLT3抑制劑。在III期QuANTUM*-First試驗(yàn)中，將口服FLT3抑制劑奎扎替尼（quizartinib）加入一線化療后，新診斷的FLT3-ITD陽(yáng)性急性髓系白血?。ˋML）患者的總生存期（OS）延長(zhǎng)了1倍以上。與單獨(dú)化療相比，奎扎替尼+化療降低了22.4%的死亡風(fēng)險(xiǎn)。在超過(guò)39個(gè)月的隨訪中，奎扎替尼組的中位OS接近32個(gè)月，而化療組為15個(gè)月。

克立福替尼是東陽(yáng)光藥自主研發(fā)的新一代、高特異性的FLT3抑制劑，擬定適應(yīng)癥為FLT3-ITD突變的AML。該藥通過(guò)干擾FLT3-ITD突變驅(qū)動(dòng)的細(xì)胞無(wú)限增殖及抗凋亡機(jī)制，達(dá)到有效治療AML的目的。目前，克立福替尼單藥治療復(fù)發(fā)/難治AML正在國(guó)內(nèi)進(jìn)行III期臨床，是國(guó)內(nèi)首個(gè)進(jìn)入III期臨床的國(guó)產(chǎn)高選擇性FLT3抑制劑，研發(fā)進(jìn)度領(lǐng)先，有望填補(bǔ)國(guó)內(nèi)靶向治療空白。與此同時(shí)，其聯(lián)合化療針對(duì)初治AML患者的Ib/II期臨床也正同步開(kāi)展，展現(xiàn)出全面覆蓋不同治療階段的潛力。

臨床前數(shù)據(jù)顯示，克立福替尼對(duì)激酶FLT3有很強(qiáng)的抑制作用；在皮下移植瘤模型中，克立福替尼最低起效劑量為0.5mg/kg/d，在中劑量（1.5mg/kg/d）即可引l起腫瘤完全消退，且在停藥后可維持腫瘤完全消退的狀態(tài)。臨床結(jié)果顯示，針對(duì)既往僅經(jīng)歷一線治療的FLT3-ITD（+）的AML患者，相較于在研同靶點(diǎn)藥奎扎替尼 (基于非頭對(duì)頭數(shù)據(jù))，克立福替尼40mg完全緩解/完全緩解伴部分血液學(xué)恢復(fù)率 (CR/CRh率)(30.8%VS11%)、CR率（7.7%VS4.1%）均更優(yōu)；在安全性方面，克立福替尼導(dǎo)致QT間期延長(zhǎng)的心臟毒性安全風(fēng)險(xiǎn)較奎扎替尼更低?？肆⒏Ｌ婺嵩谂R床前及臨床I期研究中均表現(xiàn)出顯著的抗腫瘤活性及良好的安全性，展現(xiàn)出廣闊的臨床應(yīng)用前景。

圖 6. FLT3結(jié)構(gòu)及藥物靶點(diǎn)

隨著不斷增多的新一代FLT3抑制劑的開(kāi)發(fā)和上市，F(xiàn)LT3基因突變狀態(tài)的檢測(cè)具有重要意義和越來(lái)越多的需求。

目前檢測(cè)FLT3基因突變的方法主要有熒光PCR-毛細(xì)管電泳片段分析法、Sanger法，NGS等。其中Sanger法靈敏度偏低，只能檢測(cè)到10%～20%以上的突變；NGS法檢測(cè)長(zhǎng)度一般為300bp左右，ITD突變插入長(zhǎng)度在3-400bp左右，對(duì)于長(zhǎng)片段測(cè)通較困難，NGS會(huì)產(chǎn)生一些長(zhǎng)片段插入突變的漏檢，而熒光PCR-毛細(xì)管電泳片段分析法檢測(cè)FLT3基因突變，具有靈敏度高（與NGS接近），檢測(cè)范圍廣，可檢測(cè)3-400bp插入突變的優(yōu)勢(shì)。

邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究（蘇州）有限公司應(yīng)用多重?zé)晒釶CR-毛細(xì)管電泳片段分析法自主研發(fā)了FLT3-ITD,TKD突變檢測(cè)試劑盒，檢測(cè)范圍覆蓋ITD及TKD常見(jiàn)突變熱點(diǎn)，可用于AML預(yù)后分層及FLT3靶向藥的用藥指導(dǎo)。本試劑盒靈敏度高，可檢測(cè)低至1%~2%的ITD/TKD突變，檢測(cè)速度快，一天內(nèi)可出結(jié)果。

該FLT3產(chǎn)品既可滿足藥物開(kāi)發(fā)過(guò)程的探索性研究的檢測(cè)需要，也可作為相應(yīng)靶向藥物的伴隨診斷試劑產(chǎn)品原型。

圖7. FLT3突變檢測(cè)流程圖

產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)

1、檢測(cè)范圍廣：覆蓋ITD（3-400bp插入突變）及TKD常見(jiàn)突變熱點(diǎn)(D835 、D836)，可用于AML預(yù)后分層及FLT3靶向藥的用藥指導(dǎo)

2、檢測(cè)靈敏度高：可檢測(cè)低至1%~2%的ITD/TKD突變

3、檢測(cè)周期快：兩天內(nèi)可出結(jié)果